徠卡熒光顯微鏡的工作原理
徠卡熒光顯微鏡的工作目標是對樣品得到一個放大像,使原來肉眼看不見的細節能變得清晰可見。這里有兩個基本的性能指標:一是分辨率極限,二是zui高有效放大倍數。分辨率是分辨物體細節的zui小極限。儀器可分辨的zui小細節經適當放大后,變成人眼所能看清者。顯然,如果超越了儀器分辨率的能力,即使進一步提高放大倍數,也不能讓人清晰看到更小的細節。這種現象必須借助于光的波動學說來解釋。
徠卡熒光顯微鏡中所用的可見光源是波長為400一800nm的電磁波。波傳播的特性之一是衍射。衍射就是波遇到障礙物時能偏離直線傳播的性質。根據基礎物理知識可知,由于實際光學儀器都有限制光束的“窗口”(光學顯微鏡中的“窗口”就是物鏡邊緣所限制的透光范圍),它造成的衍射效應會使每個物點形成的像都是有所擴展的衍射光斑。靠得太近的像點彼此重登起來,會使畫面中的細節變得模糊不清。其它光學顯微鏡中還有一些像差(如球差和色差等)也會使像點展寬,但它們大多可以校矯正。所以衍射差就成了限制光學顯微鏡分辨率的*重要因素。
根據Huy8en分FmsMl原理可以得出:一個物點所形成的衍射像斑是一種強度大部分(約84%)集中在中心圓斑,而周圍伴有強度逐漸減弱的若干離散同心環的衍射花樣。中心圓斑(也稱Airy圓斑)的半徑r約為:
r≈0.16λ/sinθ
式中:λ—顯微鏡像方所用介質中的光波長
θ —物鏡光闌(即物鏡“窗口”)對像點所張的半角.亦稱像方物鏡孔徑角或電子束半張角。光學儀器中通常采用Rayl出gh判據作為分辨率的標準,即當一個囚斑像約中心剛好落在另一相鄰圓斑像的邊緣上時,這兩個俄恰好能被分辨。因此圖像上可分辨的zui小距離眾就是Airy圓斑的半徑r。
通常被稱為顯微鏡的數值孔徑(numericalaperture)。由式得知,因可見光的波長局限在400nm到800nm之間,故若要縮小可分辨距離久,就必須增大數值孔徑。但是為此只能靠提高的值,具體做法可以是在載物片與物鏡之間加油滴等。